Dr hab. Jakub Drożak {ENGLISH}
Grupa badawcza
dr hab. Jakub Drożak, prof. ucz.
mgr Apolonia Witecka (doktorantka UW)
mgr Klaudia Ślusarczyk (doktorantka IMID)
mgr Julia Kamińska (doktorantka UW)
lic. Paulina Emmel (magistrantka)
Mikołaj Witczak (student)
Tematyka badawcza
Zainteresowania naukowe naszego zespołu koncentrują się na zagadnieniach związanych z identyfikacją molekularną (identyfikacją genów) enzymów sierocych kręgowców oraz ich charakterystyką biochemiczną oraz fizjologiczną. Enzymy sieroce stanowią liczną grupę białek, których aktywności (katalizowane reakcje chemiczne) zostały opisane w literaturze lub w bioinformatycznych bazach danych lecz nigdy nie poznano genów kodujących te białka. W związku z brakiem charakterystyki molekularnej i biochemicznej enzymów sierocych, nieznane są mechanizmy regulujące ich aktywność, ale przede wszystkim niewiele wiadomo o ich roli fizjologicznej.
Rozwijamy także współpracę naukową z zespołem prof. Agnieszki Rygiel z Instytut Matki i Dziecka (IMID) w Warszawie, prowadząc badania nad charakterystyką molekularną i biochemiczną wadliwych wariantów białek kodowanych przez zmutowane formy genów wykryte u polskich pacjentów.
Stosowane metody i techniki badawcze
Biochemia
– pomiary aktywności enzymów technikami chromatograficznymi, spektrofotometrycznymi oraz radiochemicznymi,
– wieloetapowe oczyszczanie aktywności enzymatycznych metodami chromatograficznymi (chromatografia jonowymienna, powinowactwa oraz oddziaływań hydrofobowych, sączenie molekularne),
– analizy czystości preparatów białek (SDS-PAGE, Western-blotting),
– identyfikacja molekularna białek oraz ich modyfikacji z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas (Q-TOF),
– analiza tożsamości molekularnej produktów aktywności enzymów (UPLC-MS, IC-MS).
Biologia molekularna
– klonowanie otwartych ramek odczytu kodujących enzymy prokariontów i eukariontów w odpowiednich wektorach ekspresyjnych,
– ukierunkowana mutageneza białek,
– edycja genomów ssaków metodą CRISPR/cas9
– produkcja rekombinowanych enzymów w bakteriach (E. coli) lub komórkach ssaczych (COS-7, HEK293T),
– oczyszczanie do homogenności rekombinowanych białek z wykorzystaniem techniki FPLC.
Główne osiągnięcia badawcze
- Identyfikacja molekularna dehydrogenazy L-fukozowej (HSD17B14) ssaków – enzymu inicjującego szlak degradacji L-fukozy (monosacharyd) w wątrobie i nerkach.
- Identyfikacja molekularna reduktazy 4-oxo-L-prolinowej i wykazanie potencjalnej roli tego enzymu w produkcji cis-4-hydroxy-L-proliny u ssaków
- Charakterystyka funkcjonalna nowych mutacji w genie ludzkiego kanału wapniowego TRPV6 i określenie ich roli w rozwoju przewlekłego zapalenia trzustki (we współpracy z prof. A. Rygiel, IMiD)
- Identyfikacja genu kodującego N-metylotransferazę histydynową aktyny człowieka (SETD3) oraz charakterystyka biochemiczna i fizjologiczna tego białka. Odkrycie tożsamości molekularnej pierwszego enzymu zdolnego do metylacji reszt histydynowych białek u zwierząt.
- Identyfikacja mechanizmów warunkujących katalizę i swoistość substratową enzymu SETD3.
- Identyfikacja genów (HNMT-like oraz C9orf41) kodujących enzymy szlaku biosyntezy anseryny (β-alanylo-Nπ-metylo-L-histydyny) u kręgowców.
- Wykazanie, że białko ACSF4 jest nowym enzymem metabolizmu β-alaniny u kręgowców, a produkt katalizowanej przez nie reakcji nie został dotąd opisany w literaturze.
- Charakterystyka biochemiczna i funkcjonalna wyżej wymienionych enzymów.
Prace doktorskie
Sebastian Kwiatkowski (2023) Charakterystyka nowych aktywności enzymatycznych cytozolowej dehydrogenazy (R)-β-hydroksymaślanowej typu 2 (BDH2) ssaków.
Prace magisterskie
Julia Kamińska (2024) Analiza funkcjonalna wybranych wariantów ludzkiej cyklohydrolazy GTP 1 w kontekście rozwoju zespołu Segawy
Varvara Kazak (2024) Wstępna charakterystyka biochemiczna dehydrogenazy L-fukozowej (EC.1.1.1.122) szczura
Kacper Domżał (2023) Wstępna analiza funkcjonalna wybranej mutacji punktowej w ludzkiej cyklohydrolazie I GTP w kontekście rozwoju zespołu Segawy
Natalia Głogowska (2022) Wstępna analiza funkcjonalna wybranych mutacji punktowych w genie dekarboksylazy DOPA (AADC) człowieka w kontekście wrodzonego niedoboru tego enzymu
Michał Zaród (2020) Analiza funkcjonalna wybranych mutacji punktowych w genie kanału wapniowego TRPV6 człowieka w kontekście rozwoju przewlekłego zapalenia trzustki u dzieci
Weronika Tomaka (2020) Oczyszczanie oraz wstępna identyfikacja N-metylotransferazy białka S100A9 szczura (Rattus norvegicus).
Maria Bożko (2018) Oczyszczanie oraz wstępna identyfikacja molekularna reduktazy 4-okso-L-prolinowej (EC 1.1.1.104) szczura (Rattus norvegicus).
Agnieszka Seliga (2017) Wstępna charakterystyka biochemiczna N-metylotransferazy histydynowej B-aktyny człowieka (EC 2.1.1.85).
Sebastian Kwiatkowski (2016) Oczyszczanie oraz identyfikacja molekularna N-metylotransferazy histydynowej ß-aktyny z mięśni szkieletowych szczura.
Maria Piecuch (2014) Charakterystyka biochemiczna białek UPF0586 homologów ludzkiego białka C9orf41.
Olga Poleszak (2013) Oczyszczanie oraz identyfikacja molekularna N-metylotransferazy karnozynowej (EC 2.1.1.22) szczura (Rattus norvegicus).
Łukasz Chrobok (2013) Identyfikacja molekularna N-metylotransferazy karnozynowej (EC 2.1.1.22) kury domowej.
Beata Kądziołka (2012) Uchylając rąbka tajemnicy…Próba identyfikacji reakcji katalizowanej przez enzym 4 rodziny syntetaz acylo-koenzymu A.
Prace licencjackie
Paulina Emmel (2023) Wrodzone zaburzenia biosyntezy serotoniny i neuroprzekaźników katecholowych u człowieka
Julia Kamińska (2022) L-fukoza – metabolizm i rola biologiczna u ssaków
Emilia Staszór (2022) Wstępna charakterystyka aktywności enzymatycznej dwudomenowej metylotransferazy z Calditerrivibrio nitroreducens
Współpromotorstwo: Rafał Augustyniak (Wydział Chemii UW) i Jakub Drożak (Wydział Biologii UW)
Varvara Kazak (2021) Enzymy jako miejsce działania związków przeciwwirusowych
Kamil Szostak (2019) Zwięzła charakterystyka enzymów ATP-grasp.
Kacper Domżał (2019) Wykorzystanie enzymów w ochronie przed działaniem bojowych środków paralityczno-drgawkowych.
Michał Zaród (2018) Metylacja białek-znaczenie biologiczne.
Weronika Tomaka (2017) Enzymatyczna terapia zastępcza wrodzonych wad metabolicznych.
Maria Bożko (2016) Enzymatyczna Terapia Zastępcza w chorobach nowotworowych trzustki.
Izabela Niemyjska (2015) Karnozyna i związki pokrewne: rola fizjologiczna i perspektywy użycia w terapii chorób człowieka.
Sebastian Kwiatkowski (2014) Enzymy korekty metabolicznej – znaczenie fizjologiczne.
Łukasz Chrobok (2011) Postulowane receptory imidazolinowe jako miejsce działania leków.
Joanna Sekuła (2011) Syntetazy peptydów nierybosomalnych: mechanizm syntezy i znaczenie farmakologiczne wytwarzanych produktów.
Joanna Kowalewska (2007) Razagilina-jako nowy lek w terapii choroby Parkinsona.
Wybrane publikacje
Maas MN, Bilgin N, Moesgaard L, Hintzen JCJ, Drozak A, Drozak J, Kongsted J, Mecinović J. (2024) Examining prestructured β-actin peptides as substrates of histidine methyltransferase SETD3. Sci Rep. 14(1):26439.
https://www.nature.com/articles/s41598-024-76562-z.pdf
Witecka A, Kazak V, Kwiatkowski S, Kiersztan A, Jagielski AK, Kozminski W, Augustyniak R, Drozak J. (2024) Hydroxysteroid 17-β dehydrogenase 14 (HSD17B14) is an L-fucose dehydrogenase, the initial enzyme of the L-fucose degradation pathway. J Biol Chem. 300(8):107501.
https://www.jbc.org/action/showPdf?pii=S0021-9258%2824%2902002-7
Akagashi M, Watanabe S, Kwiatkowski S, Drozak J, Terawaki SI, Watanabe Y. (2024) Crystal structure of L-2-keto-3-deoxyfuconate 4-dehydrogenase reveals a unique binding mode as a α-furanosyl hemiketal of substrates. Sci Rep. 14(1):14602.
https://www.nature.com/articles/s41598-024-65627-8.pdf
Al-Fakhar MSQ, Bilgin N, Moesgaard L, Witecka A, Drozak J, Kongsted J, Mecinović J. (2023) The Role of Trp79 in β-Actin on Histidine Methyltransferase SETD3 Catalysis. Chembiochem. 24(21):e202300490. https://doi.org/10.1002/cbic.202300490
Bisello G, Kusmierska K, Verbeek MM, Sykut-Cegielska J, Willemsen MAAP, Wevers RA, Szymańska K, Poznanski J, Drozak J, Wertheim-Tysarowska K, Rygiel AM, Bertoldi M. (2022). The novel P330L pathogenic variant of aromatic amino acid decarboxylase maps on the catalytic flexible loop underlying its crucial role. Cell Mol Life Sci. 2022; 79(6):305
Hintzen, J., Ma, H., Deng, H., Witecka, A., Andersen, S. B., Drozak, J., Guo, H., Qian, P., Li, H., & Mecinović, J. (2022). Histidine methyltransferase SETD3 methylates structurally diverse histidine mimics in actin. Protein Science: a publication of the Protein Society, 31(5), e4305. https://doi.org/10.1002/pro.4305
Kwiatkowski, S., Bozko, M., Zarod, M., Witecka, A., Kocdemir, K., Jagielski, A. K., & Drozak, J. (2022). Recharacterization of the mammalian cytosolic type 2 (R)-β-hydroxybutyrate dehydrogenase as 4-oxo-l-proline reductase (EC 1.1.1.104). The Journal of Biological Chemistry, 298(3), 101708. https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.101708
Bilgin, N., Moesgaard, L., Maas, M. N., Hintzen, J., Witecka, A., Drozak, J., Kongsted, J., & Mecinović, J. (2022). Importance of Ile71 in β-actin on histidine methyltransferase SETD3 catalysis. Organic & Biomolecular Chemistry, 20(8), 1723–1730. https://doi.org/10.1039/d1ob02430b
Witecka, A., Kwiatkowski, S., Ishikawa, T., & Drozak, J. (2021). The Structure, Activity, and Function of the SETD3 Protein Histidine Methyltransferase. Life (Basel, Switzerland), 11(10), 1040.https://doi.org/10.3390/life11101040
Oracz, G., Zaród, M., Ewers, M., Laumen, H., Gambin, T., Kamiński, P., Grabowska, I., Drożak, A., Kwiatkowski, S., Wertheim-Tysarowska, K., Kołodziejczyk, E., Domaszewicz, A., Dorożko, B., Kosińska, J., Głuszek, S., Kozieł, D., Płoski, R., Rosendahl, J., Witt, H., Drożak, J., Rygiel, A. M. (2021). Loss of function TRPV6 variants are associated with chronic pancreatitis in nonalcoholic early-onset Polish and German patients. Pancreatology : Official Journal of the International Association of Pancreatology (IAP), 21(8), 1434–1442. https://doi.org/10.1016/j.pan.2021.09.005
Kwiatkowski S, Drozak J. Protein Histidine Methylation. Curr Protein Pept Sci. 2020;21(7):675-689. https://www.eurekaselect.com/180353/article
Guo Q, Liao S, Kwiatkowski S, Tomaka W, Yu H, Wu G, Tu X, Min J, Drozak J, Xu C. Structural insights into SETD3-mediated histidine methylation on β-actin. Elife. 2019; 8:e43676. https://elifesciences.org/articles/43676
Kwiatkowski S, Seliga AK, Vertommen D, Terreri M, Ishikawa T, Grabowska I, Tiebe M, Teleman AA, Jagielski AK, Veiga-da-Cunha M, Drozak J. SETD3 protein is the actin-specific histidine N-methyltransferase. Elife. 2018; 7. pii: e37921. https://elifesciences.org/articles/37921
Kwiatkowski S, Kiersztan A, Drozak J. Biosynthesis of carnosine and related dipeptides in vertebrates. Curr Protein Pept Sci. 2018;19(8):771-789. http://www.eurekaselect.com/160120/article
Drozak J, Piecuch M, Poleszak O, Kozlowski P, Chrobok L, Baelde HJ, de Heer E. UPF0586 Protein C9orf41 Homolog Is Anserine-producing Methyltransferase. J Biol Chem. 2015; 290(28):17190-205. http://www.jbc.org/content/290/28/17190.long
Drozak J, Veiga-da-Cunha M, Kadziolka B, Van Schaftingen E. Vertebrate Acyl CoA synthetase family member 4 (ACSF4-U26) is a β-alanine-activating enzyme homologous to bacterial non-ribosomal peptide synthetase. FEBS J. 2014 Mar;281(6):1585-97. https://doi.org/10.1111/febs.12725
Drozak J, Chrobok L, Poleszak O, Jagielski AK, Derlacz R. Molecular identification of carnosine N-methyltransferase as chicken histamine N-methyltransferase-like protein (hnmt-like). PLoS One. 2013 May 21;8(5):e64805. https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0064805
Granty badawcze
(Kierownik projektów – dr hab. Jakub Drożak)
Projekt w realizacji:
„Charakterystyka biochemiczna i funkcjonalna dehydrogenazy 2-keto-3-deoksy-L-fukonianowej ssaków” – grant Narodowego Centrum Nauki w ramach programu „Opus” (26), 2024-2026
Opis projektu
Chociaż procesy życiowe mogą przejawiać się w organizmach żywych różnorodnie, to jednak podstawowym kryterium życia jest obecność przemian metabolicznych. Metabolizm jest systemem reakcji chemicznych i powiązanych z nim przemian energetycznych, które zachodzą w każdej żywej komórce. Reakcje te są zorganizowane w szlaki metaboliczne, które działają dzięki enzymom – białkom zdolnym do katalizy przemian chemicznych.
Blisko wiek intensywnych badań biochemicznym zaowocował bogatą wiedzą na temat szlaków metabolicznych, sprawiając wrażenie, że wszystkie przemiany metaboliczne w organizmach żywych zostały już dobrze poznane. Jednak wyniki badań nad poznaniem genomów licznych organizmów jasno wskazują na obecność wielu enzymów o nieznanej funkcji, które mogą tworzyć nowe, dotąd nieopisane, szlaki metaboliczne.
W organizmie człowieka oraz innych kręgowców występuje L-fukoza – cukier, który bierze udział w determinacji grup krwi AB0 oraz w regulacji odpowiedzi immunologicznej. Proces biosyntezy L-fukozy jest dobrze poznany, jednak bardzo niewiele wiadomo jak organizm rozkłada „nadwyżki” tego związku. Wiadomo natomiast, że taki proces zachodzi szczególnie intensywnie w wątrobie i nerkach człowieka i innych ssaków. W naszym laboratorium prowadzimy obecnie intensywne badania nad poznaniem wszystkich enzymów szlaku degradacji L-fukozy u ssaków. Wyniki naszych najnowszych prac pozwoliły ustalić tożsamość molekularną (zidentyfikować gen) jednego z enzymów szlaku – dehydrogenazy 2-keto-3-deoksy-L-fukonianowej. Co ciekawe, wykazano, że utracie tego enzymu u myszy towarzyszą poważne zaburzenia wewnątrzkomórkowej homeostazy żelaza. Jednak dokładny mechanizm tych zmian pozostaje nieznany.
Biorąc pod uwagę kluczowe znaczenie wiedzy o procesach metabolicznych dla pełnego zrozumienia funkcjonowania komórek, zarówno prawidłowych jak i zmienionych chorobowo, celem niniejszego projektu jest:
1) wytworzenie metodami inżynierii genetycznej „syntetycznych” rekombinowanych form ludzkiej i mysiej dehydrogenazy 2-keto-3-deoksy-L-fukonianowej oraz wykonanie ich pełnej charakterystyki biochemicznej i funkcjonalnej,
2) wytworzenie mysich komórek pozbawionych aktywności dehydrogenazy 2-keto-3-deoksy-L-fukonianowej, a następnie ich wykorzystanie do identyfikacji zaburzeń metabolicznych towarzyszących utracie badanego enzymu,
3) poznanie mechanizmu odpowiedzialnego za zaburzenia homeostazy żelaza w komórkach pozbawionych aktywności dehydrogenazy 2-keto-3-deoksy-L-fukonianowej.
Rekombinowane formy badanych enzymów będą wytwarzane w komórkach bakterii Escherichia coli, a ich aktywność enzymatyczna będzie mierzona spektrofotometrycznie. Natomiast tożsamość chemiczna wytworzonych produktów będzie weryfikowana metodami chromatograficznymi. Wykorzystując technikę CRISPR/Cas9 zostaną przygotowane mysie komórki pozbawione genu kodującego dehydrogenazę 2-keto-3-deoksy-L-fukonianową. Komórki te posłużą identyfikacji zaburzeń biochemicznych towarzyszących utracie zdolności do rozkładu L-fukozy. Metabolity szlaku degradacji L-fukozy będą oznaczane metodami chromatograficznymi, natomiast zmiany wewnątrzkomórkowej zawartości żelaza będą mierzone techniką radioizotopową.
Oczekujemy, że realizacja projektu doprowadzi do pełnej charakterystyki biochemicznej oraz funkcjonalnej dehydrogenazy 2-keto-3-deoksy-L-fukonianowej ssaków. Zostanie zatem określona rola tego enzymu u człowieka, ale przede wszystkim zostanie wyjaśniony mechanizm warunkujący nadmierną akumulację żelaza w komórkach pozbawionych aktywności dehydrogenazy 2-keto-3-deoksy-L-fukonianowej. Liczymy także, że uzyskane wyniki przyczynią się do identyfikacji nowych schorzeń człowieka, w których patogenezie mogą być zaangażowane enzymy degradacji L-fukozy.
Projekty zakończone
„Charakterystyka biochemiczna metylotransferazy SETD3 człowieka” – grant Narodowego Centrum Nauki w ramach programu „Opus” (14), 2018-2023
„Molekularna oraz biochemiczna charakterystyka eukariotycznego białka C9orf41” – grant Narodowego Centrum Nauki w ramach programu „Opus” (6), 2014-2016
„Molecular and biochemical characterization of Acyl-CoA Synthase family member 4, a mysterious enzyme of mammalians” – grant Fundacji na rzecz Nauki Polskiej w ramach programu “Homing plus”, 2011-2013
„Molekularna i biochemiczna charakterystyka N-metylotransferazy karnozynowej (EC 2.1.1.22)”- grant MNiSzW w ramach programu „Iuventus Plus”, 2010-2011
